肿瘤能治好吗?肿瘤免疫浅谈

肿瘤免疫发展历程

从肿瘤手术切除到今天的PD-1等免疫检查点免疫治疗，差不多经历了130年，如果说放疗能够部分激活免疫系统，那么人类非主观意识进行免疫治疗可以从1895年X-Ray的发现开始，在1896年Emil Herman Grubbe第一个应用放射治疗肿瘤。此后大约经历了半个世纪，直到1947年，Dr. Sidney Farber将氨基蝶呤用于化疗，进入2000年后，人类进入了肿瘤靶向治疗，如靶点为CD20的利妥昔单抗及靶点为V的贝伐珠单抗。在2000-2010期间，人类逐渐在主观意识上将肿瘤免疫纳入深入研究，2010年，第一个治疗性肿瘤疫苗Provenge问世，2011年靶点为CTLA-4的Yervoy被FDA批准上市，2014年针对PD-1靶点的Pembrolizumab上市更是将免疫检查点的研究推向了热潮，接下来便是我们熟知的2014年Nivolumab、2016年Atezolizumab、2017年Avelumab和Durvalumab问世、以及火热的CAR-T细胞疗法、溶瘤病毒、双特异性抗体、基因编辑等。这些治疗手段的发展也加速了我们对肿瘤免疫理解层面的拓宽，同时也进一步推进治疗手段的不断更新，使之更加合理化、个性化。

肿瘤免疫靶点及临床现状

2017年5月FDA批准Keytrude用于治疗高度微卫星不稳定（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR）实体瘤患者，这是FDA首次基于肿瘤标志物而不是肿瘤原始位置批准的一个新药。更是加速了以PD-1为代表的IO抑制剂的单药或多药联合治疗。截止2017年9月份，有940个IO药物临床试验以及1064个药物处于临床前。事实上，这940个IO抑制剂临床试验仅有40个靶点，重复研究现象普遍。在临床试验上，仅PD-1/PD-L1就开展了多达1105个临床试验，这些研究包含单药以及联合用药试验[1]。

近些年，很多免疫抑制因素被提出，更是加速了诸如新兴免疫哨卡抑制剂项目的开发研究，这些新的靶点不仅仅停留在T细胞方面，巨噬细胞Macrophage及自然杀伤细胞NK亦是被提上研究热点。使得人类对免疫机制的研究进一步加深，笔者也认为仅仅在免疫细胞方面，应该也是多角度、多视图的。免疫细胞形成的系统是一张网，在这张网中，免疫细胞占据着多个重要节点对肿瘤进行监视、狙杀。任何一个节点在免疫反应中都有着举足轻重的作用，也可能成为肿瘤的帮凶，如肿瘤微环境中的调节T细胞及M2巨噬细胞，且这些免疫细胞相互之间有着千丝万缕的关系，在肿瘤免疫中，某一种免疫细胞的损伤是否对其他免疫细胞造成影响或影响多大，我们不得而知。不过这对整体的免疫应是影响重大的。

肿瘤免疫治疗手段现状

在上述提及的940个肿瘤免疫临床药物中，可以将免疫治疗方式分为6类，如下图：

1. 位于T细胞或肿瘤细胞表面并对T细胞的激活或抑制起到调节作用的免疫检查点。如CTLA-4、PD-1、PD-L1等，已上市的都为单抗类药物。

2. 作用其他细胞或肿瘤微环境的免疫调节剂。如 IFNAR, CSF1R, IDO1, A2AR, 和KIR等靶点。其中，KIR为NK细胞靶点。吲哚胺2,3-双加氧1（IDO1）和色氨酸2,3-加氧酶（TDO）在多种肿瘤细胞及抗原提呈细胞中高表达，能够引起色氨酸过度降解和其降解产物犬尿氨酸局部升高，T细胞对色氨酸耗竭敏感，局部微环境的色氨酸浓度较低时，T细胞增殖会静止在G1期，色氨酸的代谢产物犬尿氨酸水平升高，诱导氧自由基介导的T细胞凋亡。2016 ASCO会议中公布IDO1与PD-1联合用药收效显著。2017年4月，NewLink Genetics宣布，在一项2期临床试验中，IDO通路抑制剂indoximod与PD-1单抗Keytrude的组合疗法在晚期黑色素瘤中取得了显著的疗效，效果优于Keytrude单独使用。

3. 肿瘤治疗性疫苗。即能够诱导产生特异性T细胞抗肿瘤反应，如治疗前列腺癌的癌症疫苗（Sipuleucel-T）。另外，针对肿瘤免疫的个性化多肽或RNA治疗性疫苗，目前国内外也处于积极研发中。

4. 细胞治疗。如CAR-T、CAR-NK等。

2014年7月，CTL019（诺华，PII）获突破性疗法。

2015年12月，KTE-C19（Kite，PII）获突破性疗法。

2015年11月，Kite Pharma公司axicabtagene ciloleucel（KTE-C19）用于治疗在化疗耐受侵袭性B细胞非霍金性淋巴瘤（NHL）患者客观反应率或肿瘤反应率（PR+CR）高达82%，结合CRISPR技术的CAR-T疗法将成为下一代CAR-T疗法主流。

在CAR-T研究中，CD19是最热门靶点，针对CD19的CAR-T临床试验达到56个。中国及北美走在CAR-T的研发前列，46家中国企业开展了98项临床研究，美国有22家企业参与了51项临床试验。

CAR-T细胞治疗研发进展

5. 溶瘤病毒。直接杀伤肿瘤或激活抗肿瘤免疫反应。如T-VEC。

6. 双特异性单抗。如blinatumomab。通过双抗的一个臂识别T细胞，如CD3，双抗的另一个臂识别肿瘤，如CD19，进而将T细胞带入到肿瘤细胞部位对肿瘤进行清除。

肿瘤发生及免疫机制

肿瘤是一种基因相关的疾病，致癌性基因被激活造成突变，当这种突变累计到一定负荷时，肿瘤便发生。肿瘤通过基因突变的进化深度来应对适应能力，但同时也增加了被免疫细胞识别的风险，因此在肿瘤突变和免疫逃逸之间存在一个平衡。如今，我们熟知肿瘤可以通过负调节T细胞活力逃逸免疫监视，如CTLA-4/PD-1。临床上很多患者在接受了PD-1/PD-L1，并有持久的响应，证明了治疗前T-细胞确实处于被抑制状态。

免疫抑制在有效抗癌系列反应中（免疫循环）起到很大的阻碍作用。然而，单纯的PD-1/PD-L1不足以应对免疫系统的完全逃逸，还与肿瘤内在特性相关，比如细胞因子的组成、遗传变异程度，以及外界因素诸如肠道菌群、感染几率、阳光暴晒等。这些因素共同作用并决定免疫抑制或耐受状况，对于患者应对药物治疗的反应性很重要。

免疫治疗不同于化疗、靶向治疗等。免疫治疗抗肿瘤是一个动态的过程，不局限于某一个突变靶点，而是多靶点、多方向激活调度免疫系统。因此只有对影响肿瘤免疫的诸多因素逐渐理解后才能更深入的了解患者的肿瘤免疫状况，有方向性的进行免疫激活，如今，世界上最大的临床研究应该是肿瘤免疫相关临床试验，我们期望除了临床研究终点相关结论外，还能有更多的肿瘤免疫机制研究深入其中。

接下来我们讨论下影响肿瘤免疫激活或抑制的相关因素：

肿瘤基因作为免疫驱动因素

肿瘤突变的研究从突变抗原转向新生抗原，比如黑色素瘤相关抗原3（MAGE-A3）。这类抗原能够与肿瘤细胞的MHC-I很好的结合并被展示，并且可以作为TCR识别的表位，未来可以作为肿瘤疫苗的研究方向，尽管尚未有很好的治疗性肿瘤疫苗问世，但是2017年7月份，美国波士顿达纳-法伯癌症研究所Catherine Wu教授团队和德国缅因兹大学Ugur Sahin团队分别宣布了两项临床I期试验结果，针对不同肿瘤突变定制的个性化疫苗，在黑色素瘤患者治疗中大获成功[3]。

美国和德国团队个性化疫苗制备过程

小鼠试验表明一些点突变可以引起T细胞免疫反应，利用多肽或者RNA作为治疗性疫苗可以取得显著效果，然而，实验结果显示只有10%的非同义点突变多肽与MHC-I有高亲和力，其中，只有一小部分具有高免疫原性。

当前很多对肿瘤突变研究聚焦与点突变，移码突变或密码子缺失插入都可能产生新生抗原。新生抗原的免疫原性对于免疫系统的激活研究是重要的。在T细胞方面，CD4+ T细胞对于抗肿瘤机制尚不明确，但是在抗体及CD8+ T细胞免疫反应中起到很重要的作用，自身能够分泌IFN-γ以及可以协调介导细胞毒性。黑色素瘤的多个研究报告表明浸润性CD4+/CD8+ T细胞中，存在识别突变多肽的特异性杀伤T细胞，在其他肿瘤中尚未有很多的类似突变多肽激活T细胞免疫反应，不过，在病毒治疗性疫苗方面研究足以表明新生抗原可以类似病毒抗原一样激活免疫系统，这提示肿瘤突变新生抗原未来将作为免疫治疗研究的重要方向。

 

肿瘤免疫中记忆T细胞

在感染类的模型中，对记忆T细胞做了很好的研究，事实上，肿瘤免疫中也存在类似的记忆T细胞。在小鼠试验中，接种的肿瘤消除后再次接种相同的肿瘤，不会引起肿瘤复发，而如果接种其他肿瘤则肿瘤会发生[4]。同时，在浸润性的T细胞中存在记忆T细胞的的特征。T细胞如果长期暴露于某一种抗原下，T细胞则会上调一些起激活作用的标记物，诸如PD-1这样的负调节。这将导致T细胞耗竭。

记忆T细胞是什么时间产生，如何维持的？一项慢性病毒引发的淋巴细胞脉络丛脑膜炎的研究表明，免疫系统中首先产生一种自我更新的短期记忆T细胞，这些细胞具有T-bet高表达、PD-1低表达的特征。

在PD-1/PD-L1治疗的病人中，很多患者的肿瘤持续产生免疫反应，但是肿瘤不能够完全被消除，对此有很多猜测，比如肿瘤其他路径的免疫抑制，或者肿瘤自身的进化。诚然，这种持续的PR表明在肿瘤和免疫细胞之间达到了一种新的平衡。这些记忆免疫T细胞的量已经不足以打破天平的平衡，需要进行补充。而当PD-1和CTLA-4联用时，我们看到疗效显著提高，这可能由于免疫抑制解除后，相对于单药使用有更多的T细胞被激活。在人类的肿瘤浸润性T细胞中同样存在记忆T细胞的一些特征：缺少CD62L（L-selectin）、表达RO异体CD45等，这些记忆T细胞从肿瘤浸润性T细胞中提取并体外扩增，具有很好的临床获益，表明这些具有免疫功能的T细胞确实就是记忆T细胞。

有哪些因素将对T细胞免疫产生影响？在PD-1/PD-L1治疗后，病人体内一周内可以观察到CD8+ T细胞的提升，但是这些并不能提示后续抗肿瘤反应的宽度和深度，多种因素将会对后续抗肿瘤反应起到影响，比如早期T细胞的量，其中记忆T细胞和效应T细胞的比率，浸入肿瘤后效应T细胞的存活率，因为在肿瘤深处，有大量的抗原可以引发T细胞耗竭。另外还有特异性杀伤T细胞从淋巴结点到肿瘤部位的迁移，亦会对后续的免疫反应有着重要影响。因此，较多的因素需要深入的了解才能更深层次的理解肿瘤和人体免疫记忆T细胞之间的关系，这些亦将成为未来的重要研究方向。

 

免疫治疗表型研究

免疫检查点PD-1等单药使用时，反应率在10%~40%之间，多种因素对此有着重要影响。临床研究提示表型方面有着重要的关联性。

第一类免疫炎症型。在临床样本中，炎症肿瘤周围可以检测出PD-L1、促炎因子及效应因子等，表明肿瘤周围确实存在过抗肿瘤反应的T细胞，由于肿瘤的逃逸，现处于免疫抑制状态。临床上PD-1/PD-L1等免疫抑制解除通常对这类表型有效。然而，仅仅这样的免疫反应还是不够的，免疫细胞浸润肿瘤作为充分条件，对于免疫系统的完全启动才迈开第一步。

第二类免疫豁免型。同样在肿瘤周围存在大量免疫细胞，但是不能够穿透肿瘤周围的薄壁组织浸入肿瘤，只停留在肿瘤周围的基质中。在使用PD-1/PD-L1抑制剂后，基质中的T细胞确实可以被激活并扩增，但仍然不能浸入肿瘤细胞，临床表现为无实质性免疫反应。在这种表型中，T细胞迁移是肿瘤免疫激活的抑制因素。

第三类免疫沙漠型。肿瘤内部及周围均缺乏T细胞。这种表型临床上对PD-1/PD-L1疗法基本无效。肿瘤特异性杀伤T细胞的生成是这类表型的免疫抑制因素。

对于上述三种免疫表型的临床观察基础是什么？

确定肿瘤是否处于一个炎症微环境中，这可以反应一些免疫细胞的组成、数量及其他因素存在状况。炎症的程度可以通过肿瘤中免疫细胞及细胞相关因子判断，如肿瘤周围及肿瘤内部免疫细胞情况。具有炎症的肿瘤也含有促炎症细胞因子，这为T细胞的激活提供一个更有利的环境。包括I型和II型IFNs，IL-12，IL-23，IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）和IL-2，这些细胞因子的存在是否介导免疫细胞浸入的原因尚不清晰。

非炎症肿瘤通常存在一些免疫抑制或耐受相关的细胞因子，以及能够参与免疫抑制的一些细胞，比如调节T细胞（Reg T cell）、肿瘤相关巨噬细胞（M2）。当然，调节T细胞并非只在非炎症肿瘤环境中出现，在炎症环境的激活T细胞周围也有，它在免疫反应中起到重要的调节作用。

PD-1/PD-L1抑制剂治疗对炎症型肿瘤有着较好的效果。在暴露于IFN-γ后，大部分细胞会上调PD-L1的表达，同时PD-L1也会对效应T细胞产生抑制作用，因此PD-L1可以作为一个重要的炎症型肿瘤预测指标。临床上，组织活检PD-L1高表达的病人也对PD-1/PD-L1抑制剂有着很好的响应。PD-L1的上调表达往往还与其他细胞免疫标志物有关，比如IFN-γ、颗粒酶、CXCL9/CXCL10，这些标志物的出现或者肿瘤突变负荷高的肿瘤都会对PD-1/PD-L1抑制剂有着良好响应。PD-L1结合这些标志物能够很好的对炎症型肿瘤做出预测。同时也能够进一步对肿瘤免疫机制加深理解，为病人的个性化治疗提供更多的依据。

炎症程度的不同可以反映出肿瘤基因的复杂度及微环境中的其他因子，这些因素可能随着时间改变。可以依此建立患者肿瘤随时间转移的特征图谱。因此有时候从已经接受多线药物治疗的病人获取的组织活检信息并不能真实反映情况。然而，事实上，2015年在一项研究中发现，PD-L1早期和后期、原位和转移瘤的免疫组化频度和强度信号非常相似[5]。这表明肿瘤的某些特征不会受时间和是否转移的影响，是保守的。尽管肿瘤治疗会改变肿瘤一些特征，但是这些肿瘤保守特征受到多种遗传因素及肿瘤自身因素或患者体内环境因素，是既定又稳定的。

影响免疫概况相关因素

对一个确定病人的免疫概况的决定因素或者肿瘤-免疫集合分值还不能确定，不过这些影响因素应该包括肿瘤基因的变异度、生殖遗传、表观遗传、宿主基因、年龄、微生物群、是否感染、是否阳光爆晒、药物使用等。即使同样的表型特征，病人的免疫状况还是因人而异。

对于三种基本的免疫表现型可以区别，但是炎症型病人是否一定会对免疫治疗有很好的响应呢？这与很多因素相关，比如相关的细胞因子、趋化因子、免疫-非免疫细胞，这些都将影响炎症程度，而炎症的程度与有效的抗肿瘤息息相关。

如图，影响因素的小小变化即会打破耐受-免疫之间的平衡。这些因素共同主导着耐受-免疫，即使某个因素在不同炎症状态下表现很微妙，却会和一些特定的免疫状况及临床反应程度相关。分布曲线顶端的人，变异度很低，对临床治疗的免疫反应表现出随机性。

影响肿瘤免疫激活-抑制相关多重因素

 

因此在临床上并非只要有炎症、PD-L1高表达就会对PD-1/PD-L1抑制治疗做出很好的响应，治疗效果可能是随机的。耐受-免疫之间的平衡影响因素是如何影响癌症免疫集合分值的还有待阐明，这需要通过大规模的、定量的数据集来逐渐了解。

1. 肿瘤突变负荷在免疫概况中有着重要影响。突变负荷越高，越容易产生具有免疫原性并引发T细胞反应的新生抗原。早期发生的肿瘤突变几乎出现在所有肿瘤细胞中，相较于后续出现的肿瘤突变，早期突变能够更有效的激活抗肿瘤T细胞反应，后期出现的肿瘤突变基本只局限于某个肿瘤亚群。一般认为，大部分的肿瘤突变介导并促进抗肿瘤免疫反应，然而有些肿瘤突变，尤其是驱动肿瘤发生的突变，可能具有免疫抑制效果。例如，KRAS和BRAF基因或其他激活MAP激酶途径的突变会减少MHC-I分子的转录以及其他与多肽结合锚定相关分子。这些突变可以通过减少免疫T细胞与肿瘤细胞的链接从而达到降低肿瘤炎症及肿瘤被清除的机会。

对肿瘤基因组的系统研究可以进一步揭示肿瘤遗传学与肿瘤微环境的内在联系。一项研究表明[6]，导致肿瘤复发的突变能够有效的控制MHC-I的表达水平，进而影响肿瘤的炎症。同时这份研究还发现肿瘤可以选择性的扩增表达能够逃逸免疫监视的蛋白，比如PD-L1、花生四烯酸脂氧合酶、IDO-1/IDO-2。

2. 由于表观遗传学的修饰改变了基因表达状况。microRNAs的表达可能直接与免疫微环境及免疫力相关。细胞因子的表达受到表观遗传学改变的影响。比如，肺癌中DNA甲基化会降低IL-1β的表达，另外PD-L1的表达会被microRNAs调控。PD-L1启动子的甲基化也会抑制PD-L1的表达。

3. 另一种对肿瘤免疫概况产生影响的是最初肿瘤的来源组织的表观遗传学。结直肠癌高表达TGF-β，可以通过控制调节T细胞来维持肿瘤对肠道菌群的耐受性，另外胰腺癌中高表达TGF-β促进肿瘤基质在肿瘤周围的聚集，从而限制免疫细胞的浸入。值得进一步研究的是，如胰腺癌和结直肠癌对PD-1/PD-L1抑制剂效果比较差。

4. 人们在面对传染性疾病感染时会呈现不同的反应。在慢性炎症及自身免疫紊乱时亦是如此。这可能与几个免疫基因的多样性有关。类似的，在肿瘤免疫中，人们呈现出不同的反应亦可能与这些基因多样性有关。比如，TLR4基因在乳腺癌中具有多样性，生殖遗传中丧失TLR4功能性等位基因对放疗和化疗不敏感，提示免疫反应遭到已经损伤。这种等位基因的缺失是如何改变肿瘤的耐受不得而知。其他免疫相关基因的多样性同样对免疫治疗不敏感，诸如TNF-α、NF-κB、JAK/STAT、FcγRIII、NOD2、ATG16等基因。

5. 肿瘤或宿主基因外的其他因素也会对肿瘤免疫造成影响。其中肠道菌群是一个重要因素。不仅影响癌症的发生，也会影响对化疗及免疫治疗的敏感性。在小鼠模型中，如果小鼠在移植肿瘤之前注入抗生素，那么对化疗则不敏感，这可能源于肠道内的共生菌群可以激活先天性免疫系统，这在化疗之后能够起到很好的效果。

在PD-1/PD-L1/CTLA-4抑制剂治疗中也发现共生的肠道菌群能够激活抗肿瘤反应，更为重要的是，如果免疫T细胞能够大量的浸入肿瘤，即使不进行任何治疗，肠道菌群能够自发的激活抗肿瘤反应[7]。

6. 肿瘤免疫还受到环境因素的影响。比如饮食习惯、是否有感染、药物摄入等。降低胆固醇可以改善免疫反应，长期服用他汀类药物治疗会降低对流感疫苗的免疫反应，长期爆晒也会降低免疫力，这可能与IL-6和CRP在长期爆晒下表达水平上升有关。

如上，肿瘤免疫收到多重因素影响，可以将这些因素整合到一起得到一个集合分值，这样集合分值可以作为一个判断门槛，免疫集合分值是peptide-MHC-TCR作用、特异性CD8+ T细胞中TCR信号以及内生的激活或抑制免疫调节器共同决定。同样还会受到其他外界因素的影响，比如感染、药物摄取等[8]。可以通过提升免疫刺激因素、降低免疫抑制因素来提高肿瘤患者的免疫反应。

很可能某个特定的人的癌症免疫集合分值由时间轴上的临床表现决定，肿瘤固有的免疫原性和对肿瘤反应的免疫系统驱动临床表现。也许肿瘤免疫分值是既定的，很多因素会对免疫激活或抑制造成影响，而这些影响很多只是暂时的，如果单纯生物标记物来看，很多患者的最初组织活检与用药之后的组织活检特征类似。随着时间的延续，尽管有持续的肿瘤突变，原发瘤和转移性病变可以表现出类似的免疫特征。肿瘤免疫激活分值涉及内容比较多，相关机制也很复杂，但这为肿瘤免疫提供了比较广的理解范畴，对于临床表现的数据收集及分析以及联合用药有着重要的参考意义。